Résumé
En raison de leurs propriétés physico-chimiques uniques, les nanomatériaux de la famille du graphène (GFN) sont largement utilisés dans de nombreux domaines, en particulier dans les applications biomédicales.
Actuellement, de nombreuses études ont étudié la biocompatibilité et la toxicité des GFN in vivo et intro. En général, les GFN peuvent exercer différents degrés de toxicité chez les animaux ou les modèles cellulaires en suivant différentes voies d'administration et en pénétrant à travers les barrières physiologiques, pour ensuite être distribués dans les tissus ou localisés dans les cellules, pour finalement être excrétés hors du corps.
Cette revue rassemble des études sur les effets toxiques des GFN dans plusieurs organes et modèles cellulaires. Nous soulignons également que divers facteurs déterminent la toxicité des GFN, notamment la taille latérale, la structure de surface, la fonctionnalisation, la charge, les impuretés, les agrégats et l'effet couronne, etc. De plus, plusieurs mécanismes typiques sous-jacents à la toxicité du GFN ont été révélés, par exemple, la destruction physique, le stress oxydatif, les dommages à l'ADN, la réponse inflammatoire, l'apoptose, l'autophagie et la nécrose.
Dans ces mécanismes, les voies dépendantes du TLR-, du facteur de croissance transformant β- (TGF-β-) et du facteur de nécrose tumorale-alpha (TNF-α) sont impliquées dans le réseau de voies de signalisation et le stress oxydatif joue un rôle crucial dans ces voies.
Dans cette revue, nous résumons les informations disponibles sur les facteurs de régulation et les mécanismes de la toxicité des GFN, et proposons quelques défis et suggestions pour des investigations plus approfondies sur les GFN, dans le but de compléter les mécanismes toxicologiques et de fournir des suggestions pour améliorer la sécurité biologique des GFN et faciliter leur large application.
Fond
Le graphène, qui est isolé du graphite cristallin, est une monocouche plate composée de feuilles bidimensionnelles d'un seul atome d'un réseau en nid d'abeille disposé de manière hexagonale. En raison de sa structure unique, de sa surface spécifique et de ses caractéristiques mécaniques, les fonctions et les applications du graphène ont suscité une attention considérable depuis la découverte du matériau en 2004.
Le graphène et ses dérivés comprennent le graphène monocouche, le graphène à quelques couches (FLG), l'oxyde de graphène (GO), l'oxyde de graphène réduit (rGO), les nanofeuillets de graphène (GNS) et les nanorubans de graphène, etc.
GO est l'un des dérivés chimiques du graphène les plus vitaux des nanomatériaux de la famille du graphène (GFN), qui attire de plus en plus l'attention pour ses applications biomédicales potentielles. Les matériaux à base de graphène ont généralement des tailles allant de plusieurs à des centaines de nanomètres et ont une épaisseur de 1 à 10 nm, ce qui est également la définition des « nanoparticules » ou des « nanomatériaux ».
En raison de leurs propriétés physiques et chimiques exceptionnelles, les matériaux de graphène ont été largement utilisés dans divers domaines, notamment le stockage d'énergie ; dispositifs nanoélectroniques; piles; et les applications biomédicales, telles que les antibactériens, les biocapteurs, l'imagerie cellulaire, l'administration de médicaments et l'ingénierie tissulaire.
Parallèlement à l'augmentation de l'application et de la production de GFN, le risque d'exposition professionnelle ou environnementale non intentionnelle aux GFN augmente.
Et récemment, il y a eu des recherches sur l'exposition aux GFN en milieu professionnel et des données publiées ont montré que l'exposition professionnelle aux GFN avait une toxicité potentielle pour les travailleurs et les chercheurs. Les GFN peuvent être délivrés dans l'organisme par instillation intratrachéale, administration orale, injection intraveineuse, injection intrapéritonéale et injection sous-cutanée. Les GFN peuvent induire des blessures aiguës et chroniques dans les tissus en pénétrant à travers la barrière hémato-air, la barrière hémato-testiculaire, la barrière hémato-encéphalique et la barrière hémato-placentaire, etc. et en s'accumulant dans les poumons, le foie et la rate, etc.
Par exemple, certains aérosols de nanomatériaux de graphène peuvent être inhalés et un dépôt important dans les voies respiratoires, et ils peuvent facilement pénétrer à travers les voies respiratoires trachéobronchiques puis transiter vers les voies respiratoires inférieures des poumons, entraînant la formation ultérieure de granulomes, une fibrose pulmonaire et des effets néfastes sur la santé des personnes exposées. Plusieurs revues ont décrit les propriétés uniques et résumé les dernières applications biologiques potentielles des GFN pour l'administration de médicaments, l'administration de gènes, les biocapteurs, l'ingénierie tissulaire et la neurochirurgie; évalué la biocompatibilité des GFN dans les cellules (bactériennes, mammifères et végétales) et les animaux (souris et poisson zèbre); ont collecté des informations sur l'influence des GFN dans les environnements pédologiques et aquatiques. Bien que ces revues aient discuté des profils d'innocuité et de la nanotoxicologie des GFN, les conclusions spécifiques et les mécanismes détaillés de toxicité étaient insuffisants et les mécanismes de toxicité n'ont pas été complètement résumés.
Les mécanismes toxicologiques des GFN démontrés dans des études récentes contiennent principalement une réponse inflammatoire, des dommages à l'ADN, l'apoptose, l'autophagie et la nécrose, etc., et ces mécanismes peuvent être collectés pour explorer davantage le réseau complexe de voies de signalisation régulant la toxicité des GFN.
Il convient de souligner qu'il existe plusieurs facteurs qui influencent largement la toxicité des GFN, tels que la concentration, la dimension latérale, la structure de surface et la fonctionnalisation, etc. Ici, cette revue présente un résumé complet des informations disponibles sur les mécanismes et les facteurs de régulation de la toxicité des GFN in vitro et in vivo via différentes méthodes expérimentales, dans le but de fournir des suggestions pour d'autres études sur les GFN et de compléter les mécanismes toxicologiques pour améliorer la sécurité biologique des GFN et faciliter leur large application.
Toxicité des GFN (in vivo et in vitro)
Les GFN pénètrent à travers les barrières physiologiques ou les structures cellulaires par différentes voies d'exposition ou voies d'administration et pénètrent dans le corps ou les cellules, entraînant éventuellement une toxicité in vivo et in vitro. Les différentes voies d'administration et voies d'entrée, la distribution et l'excrétion tissulaires différentes, même les divers modèles et emplacements d'absorption cellulaire, peuvent déterminer le degré de toxicité des GFN. Ainsi, les clarifier peut être utile pour mieux comprendre les lois de l'apparition et du développement de la toxicité des GFN.
Parcours administratif
Les voies d'administration courantes dans les modèles animaux comprennent l'exposition des voies respiratoires (insufflation intranasale, instillation intratrachéale et inhalation), l'administration orale, l'injection intraveineuse, l'injection intrapéritonéale et l'injection sous-cutanée. La principale voie d'exposition aux GFN dans l'environnement de travail est l'exposition des voies respiratoires. Par conséquent, l'inhalation et l'instillation intratrachéale sont principalement utilisées chez la souris pour simuler l'exposition humaine aux GFN. Bien que la méthode par inhalation fournisse la simulation la plus réaliste de l'exposition réelle, l'instillation est une méthode plus efficace et plus rapide, et il a été constaté que les GFN causaient une période d'inflammation plus longue en utilisant l'instillation (instillation intratrachéale, installation intrapleurale et aspiration pharyngée) que l'inhalation.
Les GFN ont été étudiés pour se déposer dans les poumons et s'accumuler à un niveau élevé, qui se sont maintenus pendant plus de 3 mois dans les poumons avec une élimination lente après instillation intratrachéale. L'injection intraveineuse est également largement utilisée pour évaluer la toxicité des nanomatériaux de graphène, et le graphène circule dans le corps des souris en 30 minutes, s'accumulant à une concentration de travail dans le foie et la vessie. Cependant, les dérivés de GO avaient une adsorption intestinale plutôt limitée et étaient rapidement excrétés chez les souris adultes par administration orale.
Les GO de taille nanométrique (350 nm) ont entraîné l'infiltration de moins de cellules mononucléées dans le tissu adipeux sous-cutané après injection sous-cutanée dans la région du cou par rapport aux GO de taille micronique (2 m). Les GO agglomérés près du site d'injection après injection intrapéritonéale, et de nombreux petits agrégats se sont installés à proximité de la séreuse du foie et de la rate. Les expériences sur le contact cutané ou la perméation cutanée des GFN n'ont pas été trouvées dans les articles examinés ici, et les preuves disponibles sont insuffisantes pour conclure que le graphène peut pénétrer dans la peau intacte ou les lésions cutanées. La voie des gouttes nasales, qui a été largement utilisée pour tester la neurotoxicité ou le potentiel de lésion cérébrale d'autres nanomatériaux, n'a pas été mentionnée dans les articles examinés ici.
Chemins d'entrée des GFN
Les GFN atteignent divers endroits par la circulation sanguine ou des barrières biologiques après avoir pénétré dans le corps, ce qui entraîne divers degrés de rétention dans différents organes. En raison de leur taille nanométrique, les GFN peuvent atteindre des organes plus profonds en traversant les barrières physiologiques normales, telles que la barrière hémato-air, la barrière hémato-testiculaire, la barrière hémato-encéphalique et la barrière hémato-placentaire.
Barrière air-sang
Les poumons sont une entrée potentielle pour les nanoparticules de graphène dans le corps humain par les voies respiratoires. Les nanofeuillets de GO inhalés peuvent détruire l'ultrastructure et les propriétés biophysiques du film de surfactant pulmonaire (PS), qui est la première ligne de défense de l'hôte, et révéler leur toxicité potentielle. Les particules agglomérées ou dispersées se déposent sur la surface alvéolaire interne à l'intérieur des alvéoles puis sont englouties par les macrophages alvéolaires (MA). La clairance dans les poumons est facilitée par l'escalier mucociliaire, les AM ou la couche épithéliale.
Cependant, certaines petites nanoparticules inhalées infiltrent la barrière épithéliale pulmonaire intacte et peuvent ensuite pénétrer transitoirement dans l'épithélium alvéolaire ou l'interstitium. Le graphène instillé par voie intratrachéale peut se redistribuer dans le foie et la rate en traversant la barrière air-sang. L'étude de la barrière sang-air peut attirer une attention intensive, étant donné que les chercheurs et les travailleurs sont exposés professionnellement aux GFN généralement par inhalation. Expliquer clairement comment la barrière hémato-air joue un rôle dans la toxicité des GFN peut devenir un sujet brûlant de recherche.
Barrière hémato-encéphalique
L'arrangement complexe de la barrière hémato-encéphalique, constitué d'un nombre de récepteurs membranaires et de porteurs hautement sélectifs, n'exerce qu'une influence subtile sur la circulation sanguine et le microenvironnement cérébral par rapport à l'endothélium vasculaire périphérique. Les recherches sur le mécanisme de la barrière hémato-encéphalique avaient fait quelques progrès impliqués dans les maladies et la nanotoxicité. L'imagerie par spectrométrie de masse (MSI) de désorption/ionisation laser assistée par matrice (MALDI) a révélé que rGO, avec un diamètre moyen de 342 ± 23,5 nm, pénétrait par la voie paracellulaire dans la fente inter-endothéliale d'une manière dépendante du temps en diminuant la étanchéité paracellulaire de la barrière hémato-encéphalique.
De plus, les points quantiques de graphène (GQD), d'une petite taille inférieure à 100 nm, peuvent traverser la barrière hémato-encéphalique. Les études sur la façon dont les matériaux de graphène traversent la barrière hémato-encéphalique et provoquent une neurotoxicité sont très rares, et davantage de données sont nécessaires pour tirer une conclusion.
Barrière hémato-testiculaire
Les barrières sang-testicule et sang-épididyme sont bien connues pour être parmi les barrières sanguines les plus étanches du corps des mammifères. Les particules GO d'un diamètre de 54,9 ± 23,1 nm ont eu des difficultés à pénétrer les barrières hémato-testiculaire et hémato-épididymaire après injection intra-abdominale, et la qualité du sperme des souris n'a pas été manifestement affectée même à une dose de 300 mg/kg.
Barrière sang-placenta
La barrière placentaire est indispensable au maintien de la grossesse, car elle assure l'échange de nutriments et de déchets métaboliques, exerce des fonctions métaboliques vitales et sécrète des hormones. Une revue récente a suggéré que le placenta ne constitue pas une barrière étanche contre le transfert de nanoparticules aux fœtus, en particulier contre la distribution de nanoparticules carbonées vers et dans le fœtus. Il a été suggéré que la rGO et les particules d'or (diamètre de 13 nm) sont à peine présentes ou absentes dans le placenta et le fœtus en fin de gestation après injection intraveineuse. Cependant, d'autres rapports ont montré que le transfert transplacentaire se produit à des stades tardifs de la gestation.
Une grande attention avait été accordée à la toxicité des nanomatériaux pour le développement, et des rapports ont montré que de nombreuses nanoparticules traversaient la barrière placentaire et influençaient fortement le développement des embryons.
Mais les études sur l'exposition aux matériaux de graphène à travers la barrière placentaire sont déficientes, et la façon dont ces particules se transfèrent aux embryons devrait être évaluée en détail à l'avenir.
Ces quatre barrières étaient les barrières les plus fréquemment mentionnées dans la littérature, et d'autres barrières n'ont pas été évaluées dans des études récentes, telles que les barrières cutanées, qui n'ont été mentionnées dans aucune des centaines d'études de toxicité des GFN recherchées. De plus, le mécanisme par lequel les GFN traversent ces barrières n'est pas bien compris et des enquêtes plus systématiques sont nécessaires de toute urgence.
Distribution et excrétion des GFN dans les tissus
L'absorption, la distribution et l'excrétion des nanoparticules de graphène peuvent être affectées par divers facteurs, notamment les voies d'administration, les propriétés physico-chimiques, l'agglomération des particules et le revêtement de surface des GFN.
Les différentes voies d'administration influencent la distribution des GFN, par exemple, le FLG instillé par voie intratrachéale passant à travers la barrière air-sang s'est principalement accumulé et a été retenu dans les poumons, avec 47 % restant après 4 semaines.
Le GO administré par voie intraveineuse est entré dans l'organisme par la circulation sanguine et a été fortement retenu dans les poumons, le foie, la rate et la moelle osseuse, et une infiltration de cellules inflammatoires, la formation de granulomes et un œdème pulmonaire ont été observés dans les poumons de souris après injection intraveineuse de 10 mg kg/corps poids GO. De même, une forte accumulation de dérivés GO pégylés a été observée dans le système réticulo-endothélial (RES) incluant le foie et la rate après injection intrapéritonéale. En revanche, le GO-PEG et le FLG n'ont pas montré d'absorption détectable dans le tractus gastro-intestinal ou d'absorption tissulaire par administration orale.
Les différentes propriétés des GFN, telles que leur taille, leur dose et leurs groupes fonctionnels, conduisent toujours à des résultats incohérents dans les profils de distribution du graphène. Par exemple, Zhang et al. ont trouvé que GO était principalement piégé dans les poumons de souris; cependant, Li et al. ont observé que le GO s'accumulait dans le foie de souris. Notamment, les petites feuilles de GO, d'un diamètre de 10 à 30 nm, étaient principalement distribuées dans le foie et la rate, tandis que les plus grandes feuilles de GO (10 à 800 nm) s'accumulaient principalement dans les poumons. Si la taille de GO est supérieure à la taille des vaisseaux, GO se coince généralement dans les artères et les capillaires à proximité du site d'injection. Il a été montré que l'accumulation de GO dans les poumons augmentait avec une augmentation de la dose injectée et de la taille, mais que dans le foie diminuait significativement. Le revêtement de polymères biocompatibles sur GO affecte également la biodistribution, par exemple, l'injection intraveineuse de GO-PEG et de GO-dextran (GO-DEX) s'accumule dans le système réticulo-endothélial (RES), y compris le foie et la rate, sans toxicité à court terme. De plus, la charge des protéines plasmatiques et l'adsorption des GO par les protéines plasmatiques affectent également la biodistribution.
L'excrétion et la clairance des GFN varient selon les organes. Dans les poumons, les observations ont indiqué que les NGO sont aspirés et éliminés par les AM, qui pourraient être éliminés des expectorations par clairance mucociliaire ou d'autres moyens, et 46,2 % du FLG instillé par voie intratrachéale ont été excrétés dans les fèces 28 jours après l'exposition. Dans le foie, les nanoparticules peuvent être éliminées par la voie hépato-biliaire en suivant le canal biliaire dans le duodénum. De plus, le GNS pégylé qui s'accumule principalement dans le foie et la rate peut être progressivement éliminé, probablement par excrétion rénale et fécale.
Comme récemment examiné, les feuilles GO de plus de 200 nm sont piégées par filtration physique splénique, mais de petites tailles (environ 8 nm) peuvent pénétrer dans les tubules rénaux dans l'urine et être rapidement éliminées sans toxicité évidente. Les voies d'excrétion des GFN n'ont pas encore été clairement expliquées, mais les voies rénales et fécales semblent être les principales voies d'élimination du graphène.
Récemment, la stratégie de distribution et d'excrétion/toxicité est devenue une partie importante des études nano-toxicologiques. À ce jour, plusieurs résultats controversés concernant la distribution et l'excrétion du graphène in vivo ont été rapportés dans plusieurs articles, et une évaluation systématique de la toxicocinétique des GFN est toujours nécessaire. Le métabolisme et l'excrétion des nanomatériaux sont des processus de longue durée, cependant, les études récentes sur les GFN se sont limitées à des évaluations toxicologiques à court terme, et l'accumulation et la toxicité à long terme des GFN sur différents tissus restent inconnues. Par conséquent, des études à long terme sur le dépôt et l'excrétion des GFN doivent être effectuées en utilisant différentes cellules et animaux pour garantir la biosécurité des matériaux avant leur utilisation dans des applications biomédicales humaines.
Absorption et emplacement des GFN dans les cellules
Il a également été observé que l'absorption et l'emplacement des GFN exercent des effets différents dans différentes lignées cellulaires. Le graphène est absorbé dans les cellules par diverses voies. Fondamentalement, les paramètres physico-chimiques tels que la taille, la forme, le revêtement, la charge, le diamètre hydrodynamique, le point isoélectrique et le gradient de pH sont importants pour permettre au GO de traverser la membrane cellulaire. Comme indiqué précédemment, les nanoparticules de diamètre < 100 nm peuvent pénétrer dans les cellules et celles de diamètre < 40 nm peuvent pénétrer dans le noyau.
Par exemple, les GQD pénètrent peut-être directement les membranes cellulaires, plutôt que par des voies dépendantes de l'énergie. Les plus grandes nanoparticules d'oxyde de graphène (PCGO) recouvertes de protéines (~ 1 m) pénètrent dans les cellules principalement par phagocytose, et les plus petites nanoparticules de PCGO (~ 500 nm) pénètrent dans les cellules principalement par endocytose médiée par la clathrine. Les feuilles de GO pourraient adhérer et s'enrouler autour de la membrane cellulaire, s'insérer dans la bicouche lipidique ou être internalisées dans la cellule à la suite d'interactions avec les cellules.
De même, il a été démontré que l'oxyde de graphène réduit pégylé (PrGO) et le rGO adhèrent à la membrane cellulaire de la bicouche lipidique en raison de l'interaction de domaines graphitiques hydrophobes non modifiés avec la membrane cellulaire.
Par conséquent, il a été suggéré qu'une exposition prolongée ou une concentration élevée de graphène induisait des dommages physiques ou biologiques à la membrane cellulaire, ainsi qu'une déstabilisation des filaments d'actine et du cytosquelette.
Les données actuelles démontrent que les feuillets GO interagissent avec la membrane plasmique et sont phagocytés par les macrophages. Trois récepteurs majeurs sur les macrophages participent à la phagocytose du GNS : le récepteur Fcg (FcgR), le récepteur du mannose (MR) et le récepteur du complément (CR). De plus, FcgR est un récepteur clé dans la voie phagocytaire médiée. La couronne protéique de GO favorise la reconnaissance par les récepteurs des macrophages, en particulier les IgG contenus dans la couronne protéique. On a observé que les macrophages subissent des changements morphologiques prodigieux au contact de GO. Après internalisation, le graphène s'est accumulé dans le cytoplasme cellulaire, l'espace périnucléaire et le noyau, ce qui a induit une cytotoxicité dans les macrophages murins en augmentant les ROS intracellulaires par épuisement du potentiel de la membrane mitochondriale et en déclenchant l'apoptose par activation de la voie mitochondriale. Les interactions possibles et les sites d'accumulation des GFN sont résumés dans la figure 1.
Matériaux de graphène et leurs interactions biologiques. (A) Un espace de paramètres pour les matériaux de graphène les plus largement utilisés peut être décrit par les dimensions et la fonctionnalisation de surface du matériau, cette dernière étant définie comme le pourcentage d'atomes de carbone dans l'hybridation sp3.
Les carrés verts représentent le graphène développé par épitaxie ; graphène jaune, exfolié mécaniquement; graphène rouge exfolié chimiquement; bleu, oxyde de graphène. Notez qu'un certain nombre d'autres matériaux liés au graphène (tels que les points quantiques de graphène et les nanorubans de graphène) sont également utilisés dans des expériences. (B) Interactions possibles entre les matériaux liés au graphène avec les cellules (les flocons de graphène ne sont pas à l'échelle). (a) Adhérence sur la surface externe de la membrane cellulaire. (b) Incorporation entre les monocouches de la bicouche lipidique de la membrane plasmique. (c) Translocation de membrane. (d) Internalisation cytoplasmique. (e) Endocytose médiée par la clathrine. (f) Internalisation endosomale ou phagosomique. (g) Localisation lysosomale ou autre compartiment périnucléaire. (h) Localisation exosomale. Les résultats biologiques de telles interactions peuvent être considérés comme défavorables ou bénéfiques, selon le contexte de l'application biomédicale particulière. Différents matériaux liés au graphène auront différents mécanismes préférentiels d'interaction avec les cellules et les tissus qui attendent largement d'être découverts. Copyright (2014), avec la permission de l'American Association for Advancement of Science
Toxicité des GFN dans les organes
La toxicité et la biocompatibilité des GFN ont été observées et évaluées par des études théoriques et sur des modèles animaux. À l'heure actuelle, il existe une masse de données démontrant la toxicité des GFN dans différents organes ou systèmes chez les animaux, de sorte qu'il est difficile de répertorier toutes les données dans cette revue. Ainsi nous avons résumé un certain nombre de littérature et choisi quelques études toxicologiques in vivo des GFN répertoriées dans le tableau 1.
Lien vers Tableau 1 Toxicité des GFN dans les organes
Toxicité dans les organes internes
GO peut entraîner une réponse inflammatoire aiguë et des lésions chroniques en interférant avec les fonctions physiologiques normales d'organes importants. Les expériences de gavage oral n'ont pas montré d'absorption détectable de GO par le tractus gastro-intestinal. Intéressant, une faible dose de GO a causé de graves dommages au tractus gastro-intestinal après que les souris maternelles aient bu une suspension de GO plutôt qu'une dose élevée de GO, car une faible dose de GO sans agglomération peut facilement se fixer à la surface gastro-intestinale et provoquer la destruction par son abondant arêtes vives.
Les GFN ont provoqué une inflammation et sont restés dans les poumons au jour 90 après une seule instillation intratrachéale, et ont même été transférés dans les ganglions lymphatiques pulmonaires par une inhalation nasale uniquement. Une dose élevée de GO qui forme des agrégats peut bloquer les vaisseaux sanguins pulmonaires et entraîner une dyspnée, et des thrombus plaquettaires ont été observés à des concentrations élevées de 1 et 2 mg/kg de poids corporel par injection intraveineuse. GO aurait perturbé la barrière alvéolo-capillaire, permettant aux cellules inflammatoires de s'infiltrer dans les poumons et de stimuler la libération de cytokines pro-inflammatoires.
La fibrose et l'inflammation pourraient être vérifiées par les niveaux accrus des marqueurs protéiques collagène1, Gr1, CD68 et CD11b dans les poumons.
L'utilisation de Tween 80 pour disperser le FLG ou d'un surfactant pluronique pour disperser le graphène a été suggérée pour réduire la probabilité de formation de fibrose pulmonaire dans les cellules ou les souris, tandis que la fibrose pulmonaire a été observée lorsque le graphène était mis en suspension avec de l'albumine sérique bovine (BSA).
De plus, des isotopes radioactifs peuvent être délivrés dans les poumons, accompagnés d'une distribution en profondeur de 125I-NGO dans les poumons, et les isotopes pourraient s'y déposer et entraîner des mutations et des cancers. Cependant, des publications récentes n'ont affirmé aucun changement pathologique évident chez les souris exposées à de faibles doses de GO et de graphène fonctionnalisé par injection intraveineuse, y compris GO aminé (GO-NH2), GO poly(acrylamide) fonctionnalisé (GO-PAM), poly(acide acrylique) )-GO fonctionnalisé (GO-PAA) et GO-PEG ; seuls GO-PEG et GO-PAA induisaient moins de toxicité que le GO vierge in vivo. Ainsi, les groupes fonctionnels des GFN et la concentration de travail ou l'état global influencent largement la toxicité des GFN. Récemment, les moyens de modifier le groupe fonctionnel des GFN, de diminuer la concentration de travail ou de modifier l'état global sont généralement utilisés pour diminuer la toxicité des GFN.
Toxicité dans le système nerveux central
Le graphène a largement profité à la neurochirurgie avec l'application de l'administration de médicaments/gènes pour le traitement des tumeurs cérébrales, les dispositifs biocompatibles intracrâniens et rachidiens, les techniques de biodétection et de bioimagerie.
Des études concernant les potentialités ou les risques du graphène dans le cerveau ont vu le jour. Dans le modèle d'embryon de poulet, les flocons de graphène vierge ont diminué le niveau d'acide ribonucléique et le taux de synthèse d'acide désoxyribonucléique, entraînant des effets nocifs sur le développement du tissu cérébral et l'ultrastructure atypique a été observée dans le cerveau. Les recherches récentes sur les GFN dans le système nerveux central sont principalement impliquées dans l'application plutôt que dans la toxicité.
Les données de l'étude de toxicité sur les GFN sont en cours.
Toxicité dans le système de reproduction et de développement
Le graphène vierge a réduit la vascularisation du cœur et la densité des vaisseaux ramifiés après injection dans des œufs de poule fécondés suivie d'une incubation de 19 jours.
GO et rGO endommagent les embryons de poisson zèbre en influençant le taux d'éclosion des embryons et la longueur du corps d'une manière dépendante de la concentration.
Bien qu'aucune malformation ou mortalité évidente n'ait été observée chez les embryons de poisson zèbre exposés, GO a adhéré et a été enveloppé dans le chorion des embryons de poisson zèbre, provoquant une hypoxie et un retard d'éclosion remarquables.
Les agrégats GO étaient retenus dans de nombreux organites, tels que les yeux, le cœur, le sac vitellin et la queue des embryons, et l'apoptose et la génération d'espèces réactives de l'oxygène (ROS) ont été observées dans ces régions.
Les GFN exercent des effets toxicologiques différents sur le système reproducteur masculin ou féminin. Les données ont montré que la GO exerçait des effets toxiques très faibles ou presque nuls sur la reproduction mâle, même à forte dose via une injection intra-abdominale. De plus, rGO n'a pas modifié les taux sériques d'œstrogènes des souris femelles non gravides. La condition est différente chez la souris femelle : les mères de souris pourraient donner naissance à une progéniture saine après l'injection de rGO avant l'accouplement ou au début de la gestation, et seuls quelques fœtus anormaux étaient présents parmi les portées de mères ayant reçu une injection de rGO. Cependant, les souris gravides ont eu des avortements à toutes les doses, et la plupart des souris gravides sont mortes lorsque la dose élevée de rGO a été injectée en fin de gestation.
Notamment, le développement de la progéniture dans le groupe à dose élevée a été retardé pendant la période de lactation. La forte dose de GO a diminué la consommation d'eau des souris maternelles par exposition orale, ce qui a réduit la production de lait et ainsi retardé la croissance de la progéniture. Bien que les résultats indiquent que les GFN sont potentiellement nocifs pour le développement, les données sur la toxicité pour la reproduction et le développement sont encore insuffisantes. Des études sur l'influence des GFN sur la reproduction et le développement des mâles et des femelles sont encore nécessaires pour élucider le mécanisme de toxicité sous-jacent.
Influence de l'hémocompatibilité
La libération de GO dans le sang est inéluctable. L'hémocompatibilité de GO s'est avérée dépendante du revêtement fonctionnel et des conditions d'exposition. GO avec une taille submicronique a entraîné la plus grande activité hémolytique, tandis que le graphène agrégé a induit la réaction hémolytique la plus faible. Le graphène vierge et le GO ont démontré un effet hémolytique jusqu'à 75 g/mL. La GO-polyéthylèneimine (GO-PEI) a montré une toxicité notable en se liant à la HSA, même à 1,6 μg/mL. L'oxyde de graphène carboxylé (GO-COOH) a montré une cytotoxicité significative envers les lymphocytes T à des concentrations supérieures à 50 g/mL et avait une bonne biocompatibilité en dessous de 25 g/mL, tandis que le GO-chitosane a presque inhibé l'activité hémolytique. Jusqu'à présent, le risque d'hémocompatibilité correspondant est resté largement inconnu.
En conclusion, la lésion pulmonaire induite par les GFN a été étudiée dans plusieurs études, dont les résultats ont démontré une infiltration cellulaire inflammatoire, un œdème pulmonaire et la formation de granulomes dans les poumons. Cependant, seules quelques études spécifiques ont évalué dans d'autres organes, tels que le foie, la rate et les reins, et les symptômes des blessures, l'indice de dommages et le niveau de dommages à ces organes internes n'ont pas été complètement étudiés. De plus, les études sur la neurotoxicité des GFN sont assez rares ; aucune donnée n'a révélé quels nerfs ou zones du cerveau subissent des dommages, et les manifestations comportementales associées n'ont pas été étudiées.
La toxicité développementale des GFN peut induire des anomalies structurelles, un retard de croissance, des anomalies comportementales et fonctionnelles, et même la mort.
Une étude sur la toxicité des GFN pour la reproduction et le développement sera extrêmement importante et attirera beaucoup d'attention à l'avenir. Presque toutes les études de toxicité des GFN étaient des expériences de courte durée, et aucune étude n'a examiné les lésions toxiques chroniques à long terme. Cependant, sur la base d'études sur la toxicité d'autres nanomatériaux, l'exposition à long terme aux GFN peut être un facteur important nuisible à la santé. Par conséquent, l'étude à long terme des GFN est nécessaire.
Toxicité des GFN dans les modèles cellulaires
La cytotoxicité des GFN in vitro a été vérifiée dans diverses cellules pour modifier la viabilité et la morphologie cellulaires, détruire l'intégrité de la membrane et induire des dommages à l'ADN. GO ou rGO diminuent l'adhésion cellulaire ; induire l'apoptose cellulaire; et pénètrent dans les lysosomes, les mitochondries, les noyaux cellulaires et l'endoplasme. Les GQD ont pénétré les cellules et ont induit des dommages à l'ADN par l'augmentation de l'expression des protéines p53, Rad 51 et OGG1 dans les cellules NIH-3 T3. Cependant, les GQD n'ont pas présenté de toxicité significative pour les lignées cellulaires de cancer du sein humain (à une dose de 50 g/mL) ou les cellules souches neurales humaines (à une dose de 250 μg/mL). Les dérivés GO ont considérablement diminué l'expression des gènes différentiels responsables de la structure et de la fonction de la membrane cellulaire, tels que la régulation du cytosquelette d'actine, l'adhésion focale et l'endocytose. Dans les cellules de phéochromocytome de rat (cellules PC12), le graphène et le rGO ont provoqué des effets cytotoxiques et des lésions mitochondriales, telles que la libération de lactate déshydrogénase (LDH), une augmentation de l'activation de la caspase-3 et la génération de ROS.
Le graphène peut augmenter la viabilité cellulaire ou provoquer la mort cellulaire selon la lignée cellulaire, le type de matériau de graphène et le dosage. Une cytotoxicité GO a été observée dans les fibroblastes humains et les cellules épithéliales pulmonaires à des concentrations supérieures à 20 g/mL après 24 h, mais une toxicité minimale a été trouvée dans les cellules A549 à des concentrations supérieures à 50 g/mL. Les réponses biologiques induites par les GO telles que les ROS, le malondialdéhyde (MDA) et la LDH ont augmenté, tandis que la superoxyde dismutase (SOD) a diminué de manière dose-dépendante dans les cellules HeLa. Cependant, le GO-molecular beacon (GO-MB) a montré une faible cytotoxicité même à 20 g/mL dans les cellules HeLa. GO a diminué la viabilité des cellules A549, tandis que la même concentration et le même temps d'exposition ont augmenté la viabilité cellulaire des cellules de carcinome colorectal CaCo2.
Une autre étude a rapporté que GO a considérablement amélioré la différenciation de SH-SY5Y, accompagnée d'une augmentation de la longueur des neurites et de l'expression du marqueur neuronal MAP2 à de faibles concentrations, mais que GO a supprimé la viabilité des cellules SH-SY5Y à des doses élevées (≥80 mg/mL). Les revêtements fonctionnalisés sur GO, tels que GO-PEG et GO-chitosan, peuvent atténuer profondément la cytotoxicité des particules en inhibant les interactions entre les cellules.
La toxicité des GFN in vitro est résumée dans le tableau 2. Les données sur la cytotoxicité des nanomatériaux de graphène sont contrastées et des caractéristiques variables influencent les résultats. Les mécanismes et les facteurs d'influence de la toxicité doivent être élucidés en détail.
Lien vers Tableau 2 Toxicité des GFN dans les modèles cellulaires
Origines de la toxicité des GFN
Il semblerait que les caractéristiques du graphène, notamment sa concentration, sa dimension latérale, sa structure de surface, ses groupes fonctionnels, sa pureté et sa couronne protéique, influencent fortement sa toxicité dans les systèmes biologiques.
Concentration
De nombreux résultats ont montré que les matériaux de graphène provoquent une toxicité dose-dépendante chez les animaux et les cellules, comme des lésions hépatiques et rénales, la formation de granulomes pulmonaires, une diminution de la viabilité cellulaire et l'apoptose cellulaire. Des études in vivo, GO n'a pas montré de toxicité évidente chez les souris exposées à une dose faible (0,1 mg) et moyenne (0,25 mg) mais a induit une toxicité chronique à une dose élevée (0,4 mg). La teneur élevée en GO se déposait principalement dans les poumons, le foie, la rate et les reins et était difficile à nettoyer par les reins via une seule injection dans la veine caudale. Curieusement, l'augmentation de la dose a entraîné une diminution spectaculaire de la captation hépatique mais une augmentation de la captation pulmonaire de s-GO par injection intraveineuse, car la dose élevée de GO a potentiellement dépassé la saturation de captation ou a épuisé la masse d'opsonines plasmatiques , ce qui a par conséquent supprimé l'absorption hépatique. De plus, une étude in vitro a rapporté que 20 g/mL de nanofeuillets de GO ne présentaient aucune cytotoxicité dans A549 dans les 2 h d'incubation, mais une concentration plus élevée (85 g/mL) a diminué la viabilité cellulaire à 50 % dans les 24 h. Lu et al. a également démontré que GO n'avait pas de cytotoxicité évidente à de faibles concentrations pendant 96 h dans une lignée cellulaire de neuroblastome humain SH-SY5Y, mais la viabilité des cellules a fortement diminué à 20 % après un traitement avec 100 mg/mL de GO pendant 96 h d'incubation.
Les résultats dans les cellules HeLa, les cellules NIH-3 T3 et les cellules de cancer du sein (SKBR3, MCF7) traitées avec des nanorubans de graphène ont également montré une diminution de la dose (10 à 400 mg/ml) et du temps (12 à 48 h) viabilité cellulaire.
Des concentrations croissantes de GO sont entrées dans les lysosomes, les mitochondries, l'endoplasme et le noyau cellulaire. Plusieurs données ont indiqué que la rGO provoquait la mort cellulaire induite par l'apoptose à une dose plus faible et à un moment précoce, mais que la nécrose était prévalente avec l'augmentation du temps/dose.
Dimension latérale
Les nanoparticules de taille < 100 nm peuvent pénétrer dans la cellule, < 40 nm peuvent pénétrer dans le noyau et inférieures à < 35 nm peuvent traverser la barrière hémato-encéphalique. Une étude a montré que GO (588, 556, 148 nm) n'entrait pas dans les cellules A549 et n'avait aucune cytotoxicité évidente. Lorsque le diamètre du graphène est compris entre 100 ~ 500 nm, la plus petite taille peut provoquer la toxicité la plus grave, et lorsque le diamètre est inférieur à 40 nm, les plus petites tailles peuvent être les plus sûres.
Par exemple, rGO d'un diamètre de 11 ± 4 nm pourrait entrer dans le noyau des hMSC et provoquer des aberrations chromosomiques et une fragmentation de l'ADN à de très faibles concentrations de 0,1 et 1,0 mg/mL en 1 h.
Cependant, les feuilles de rGO d'un diamètre de 3,8 ± 0,4 nm n'ont présenté aucune génotoxicité notable dans les CSM même à une dose élevée de 100 mg/mL après 24 h.
Dans une étude in vivo, le s-GO (100 à 500 nm) s'accumulait préférentiellement dans le foie, tandis que le l-GO (1 à 5 m) était principalement localisé dans les poumons car le l-GO formait de plus gros complexes GO-protéine qui ont été filtrés. par les vaisseaux capillaires pulmonaires après injection intraveineuse. Compte tenu des tailles latérales relatives (205,8 nm, 146,8 nm et 33,78 nm) des trois nanofeuillets de GO à la même concentration, les GO plus petites subissent une absorption beaucoup plus importante que les GO plus grandes dans les cellules Hela. L'absorption élevée de s-GO a changé dans le microenvironnement des cellules et a par conséquent induit la plus grande perte de viabilité et le stress oxydatif le plus grave parmi trois tailles d'échantillons de GO. En conséquence, une étude a délimité que GO en fonction de la taille induit la polarisation M1 des macrophages et des réponses pro-inflammatoires in vitro et in vivo. Une plus grande GO a montré une adsorption plus forte sur la membrane plasmique avec moins de phagocytose, provoquant des interactions robustes avec les TLR et activant les voies NF-κB, par rapport aux feuilles GO plus petites, qui étaient plus probablement absorbées par les cellules. Pour découvrir davantage le mécanisme détaillé sous-jacent à ces effets, d'autres études sont nécessaires pour illustrer le mécanisme vital de la taille latérale des matériaux de graphène.
Structure de surface
Les GFN possèdent des chimies de surface très variables. Par exemple, la surface vierge du graphène est hydrophobe, la surface GO est partiellement hydrophobe avec des groupes carboxylate et rGO a une hydrophilie intermédiaire. Il a été observé que les GFN perturbent la fonction et la structure des membranes cellulaires et des protéines probablement par des interactions moléculaires exceptionnellement fortes avec les cellules. Par exemple, rGO s'est lié aux membranes cellulaires, a stimulé les récepteurs et activé les voies mitochondriales, induisant l'apoptose. Des preuves limitées ont montré que la GO est plus petite et moins toxique que la rGO en raison de la teneur élevée en oxygène, des bords plus lisses et des propriétés hydrophiles de la première espèce. En raison des différents états d'oxydation de surface de GO et rGO, GO possédant une hydrophilie distincte pourrait être facilement internalisé et absorbé par les cellules HepG2. Au contraire, la rGO avec une hydrophobie évidente pourrait être adsorbée et agrégée à la surface des cellules sans (ou avec une plus faible) absorption. En raison de fortes interactions d'empilement π-π, le graphène est hautement capable de casser de nombreux résidus de la protéine, en particulier les résidus aromatiques, tels que le casque villin (HP), F10, W23 et F35. Les structures secondaires et tertiaires de la protéine reposent en grande partie sur la surface du graphène, perturbant la structure et la fonction de la protéine (Fig. 2). De plus, GO peut s'insérer entre les paires de bases d'ADN double brin et perturber le flux d'informations génétiques au niveau moléculaire, ce qui pourrait être l'une des principales causes de l'effet mutagène de GO.
Une trajectoire représentative de HP35 s'adsorbant sur le graphène. (a) Instantanés représentatifs à différents moments. Les protéines sont représentées dans des dessins animés avec une hélice rouge et une boucle verte, et le graphène est représenté dans le blé. Les résidus aromatiques qui forment les interactions d'empilement π-π sont représentés en bleu, les autres sont représentés en vert. (b) La surface de contact de HP35 avec le graphène. (c) Le RMSD de HP35 à partir de sa structure native et le nombre de résidus dans la structure de l'hélice . Ici, les structures secondaires sont déterminées par le programme DSSP. (d) La distance entre le graphène et les résidus aromatiques, y compris F35, W23, F10, F17 et F06. Pour montrer plus clairement le processus d'adsorption, l'axe χ a été tronqué et redimensionné. Copyright (2011), avec la permission du Journal of Physical of Chemistry
Charge
Un certain nombre d'études ont mis en évidence l'importance de la charge de surface GO en raison de sa capacité à affecter le mécanisme d'internalisation et d'absorption des cellules. L'internalisation du GO était négligeable dans les non-phagocytes, ce qui était probablement dû à la forte répulsion électrostatique entre le GO chargé négativement et la surface cellulaire. Cependant, d'autres ont suggéré que les nanoparticules chargées négativement peuvent être internalisées dans des cellules non phagocytaires en se liant à des sites cationiques disponibles à la surface cellulaire et être absorbées par des récepteurs charognards. Les particules GO/GS provoqueraient des changements morphologiques et une lyse significative, conduisant à une hémolyse élevée dans les globules rouges (GR).
La rupture de la membrane des globules rouges est probablement attribuée aux fortes interactions électrostatiques entre les groupes d'oxygène chargés négativement sur la surface GO/GS et les lipides phosphatidylcholine chargés positivement sur la membrane externe des globules rouges.
Fonctionnalisation
Des études ont confirmé que la fonctionnalisation avec PEG, poly-L-lysine PEGylée (PLL), poly(ε-caprolactone), alcool polyvinylique, Pluronic, amine, carboxyle, et les groupes dextran diminuent largement la toxicité et améliorent la biocompatibilité du graphène.
Les résultats in vivo ont révélé que seule une légère inflammation chronique est apparue après l'injection sous-cutanée d'hydrogel GO-Pluronic et aucune toxicité notable à court terme n'a été testée après l'injection intraveineuse de GO-DEX. La GS pégylée n'a pas induit de toxicité appréciable chez les souris exposées à 20 mg/kg pendant 3 mois, tel qu'évalué par la biochimie sanguine et les examens histologiques, et a montré une rétention relativement faible dans le RES. L'enrobage de GO avec du chitosane a presque éliminé l'activité hémolytique dans le sang. De plus, le revêtement PEG a efficacement atténué les lésions tissulaires aiguës induites par GO ; diminution de l'agrégation et de la rétention de GO dans le foie, les poumons et la rate ; et a favorisé la clairance de GO, GO-DEX et de l'oxyde de graphène fluoré (FGO).
In vitro, plusieurs tests de fonction cellulaire ont clairement montré que la fonctionnalisation de surface du graphène vierge ou GO était essentielle pour réduire les effets de forte toxicité. PEG-GO, PEI-GO et LA-PEG-GO ont moins endommagé les fibroblastes pulmonaires humains que GO. Le PEG-GO n'a présenté aucune cytotoxicité envers plusieurs cultures cellulaires, telles que les cellules de glioblastome (U87MG), les cellules de cancer du sein (MCF-7), les cellules de carcinome de l'ovaire humain (OVCAR-3), les cellules de cancer du côlon (HCT-116) et les cellules lymphoblastoïdes (RAJI), à des concentrations allant jusqu'à 100 g/mL. Les GQD-PEG présentaient une toxicité très faible ou nulle contre les cellules cancéreuses du poumon et du col de l'utérus, même à des concentrations très élevées (200 g/mL). Cependant, en tant que matériau non biodégradable avec un grand potentiel d'internalisation cellulaire, une enquête plus approfondie est nécessaire pour évaluer les éventuels effets néfastes à long terme du graphène fonctionnalisé.
Agrégations et sédimentation
Les nanomatériaux auraient tendance à former des agrégats plutôt que des unités individuelles, en particulier dans des conditions physiologiques. Les surfaces GS permettaient à moins de globules rouges de se fixer par rapport à GO, et GS avait l'activité hémolytique la plus faible pour la formation d'agrégats plus aqueux. En revanche, la sédimentation rapide et la formation d'agrégats de GS ont fortement inhibé la disponibilité des nutriments des cellules fibroblastiques de la peau humaine qui ont été cultivées au fond des puits. Par conséquent, les agrégations et la sédimentation des particules de graphène exercent des effets variables sur différentes cellules.
Impuretés
La pureté du nanomatériau est une considération importante car les métaux contaminants résiduels peuvent être responsables de la toxicité observée, plutôt que le nanomatériau lui-même, ce qui a entraîné des données contradictoires sur la cytotoxicité des GFN.
Le GO préparé traditionnellement contient souvent des niveaux élevés de Mn2+ et Fe2+, qui sont hautement mutagènes pour les cellules. La libération non spécifique de ces ions à partir de GO traditionnellement préparée pourrait conduire à des niveaux inhabituellement élevés de cytotoxicité et de fracturation de l'ADN. En particulier, Peng et al. ont produit du GO de haute pureté contenant seulement 0,025 ppm de Mn2+ et 0,13 ppm de Fe2+, et Hanene et al. ont inventé une nouvelle méthode pour préparer des feuilles GO monocouche de haute pureté avec une bonne dispersibilité aqueuse et une bonne stabilité colloïdale.
Les GO produites par ces nouvelles méthodes n'ont pas induit de réponses cytotoxiques significatives (à des doses d'exposition allant jusqu'à 100 g/mL) in vitro, et aucune réponse inflammatoire évidente ou formation de granulomes (doses d'exposition jusqu'à 50 g/animal) n'a été observée in vivo. Par conséquent, la pureté des GFN mérite l'attention et constitue une étape vitale vers la détermination des GFN impliqués dans les bioapplications.
Effet corona protéiné
En raison de la charge de surface libre élevée, les nanomatériaux peuvent facilement former des « coronas » avec des protéines dans les systèmes biologiques. Il est suggéré que la couronne protéique affecte la circulation, la distribution, la clairance et la toxicité des nanoparticules. Plusieurs articles ont rapporté que GO forme des couronnes de protéines GO avec des protéines plasmatiques adsorbées dans le sérum et ces couronnes de protéines GO jouent un rôle important dans la décision du devenir du comportement biocinétique de GO in vivo. De telles couronnes de protéines GO peuvent réguler l'adhésion de GO aux cellules endothéliales et immunitaires par le biais d'interactions spécifiques et non spécifiques.
Fondamentalement, l'immunoglobuline G et les protéines du complément dans la couronne protéique aident à réorganiser les nanoparticules dans les cellules immunitaires, provoquant l'absorption des particules par le RES, et la GO recouverte d'IgG a été absorbée par des interactions spécifiques ou non spécifiques avec les récepteurs de la membrane cellulaire. Cependant, une autre étude a révélé que GO ne pouvait pas adhérer aux cellules épithéliales muqueuses directement dans le tractus intestinal après que les souris filiales aient bu une solution aqueuse de GO parce que des protéines abondantes dans le lait s'étaient adsorbées à la surface de la GO et inhibaient ainsi leur interaction directe avec le GO des cellules épithéliales muqueuses. La couronne protéique a atténué la cytotoxicité de GO en limitant son interaction physique avec la membrane cellulaire et en réduisant les dommages morphologiques cellulaires dans les cellules HeLa, THP-1 et A549. L'effet cytotoxique était largement réduit lorsque GO était pré-enduit de FBS et incubé avec des cellules ; près de 90 % de survie ont été observés avec 100 g/mL de GO recouvert de FBS et 100 % de survie avec 20 g/mL de GO recouvert de FBS. Des tendances similaires ont été observées pour les GO couvertes par la BSA. De manière cohérente, un supplément de sérum pourrait neutraliser la toxicité du GO vierge dans les cellules J774.A1 à une dose de 4 g/mL, ce qui entraînerait une diminution du nombre de cellules de 52,5 % par rapport aux cellules non traitées.
Après avoir examiné de nombreuses études, on peut conclure que la toxicité du graphène est influencée par de multiples facteurs. Ces facteurs se sont combinés pour modifier en grande partie la toxicité des GFN dans de nombreux cas. Les études scientifiques ont souvent besoin d'une identification claire de la cause et de l'effet, qui ne devraient conserver qu'un seul facteur différent à la fois, afin que l'effet de ce seul facteur puisse être déterminé.
Mais dans certains articles, plusieurs facteurs influençant la toxicité des GFN ont été étudiés en même temps, ce qui a conduit à des résultats confus.
Mécanismes de toxicité possibles des GFN
Bien que certaines propriétés physico-chimiques et la toxicité des GFN aient été bien étudiées par de nombreux chercheurs, les mécanismes exacts sous-jacents à la toxicité des GFN restent obscurs. Un schéma des principaux mécanismes de la cytotoxicité des GFN est illustré à la figure 3.
Le diagramme schématique a montré les mécanismes possibles de la cytotoxicité des GFN. Les GFN pénètrent dans les cellules de différentes manières, ce qui induit la génération de ROS, l'augmentation de LDH et de MDA et la libération de Ca2+. Par la suite, les GFN provoquent des types de lésions cellulaires, par exemple des lésions de la membrane cellulaire, une inflammation, des lésions de l'ADN, des troubles mitochondriaux, une apoptose ou une nécrose.
Destruction physique
Le graphène est un nanomatériau unique par rapport aux autres nanoparticules sphériques ou unidimensionnelles en raison de sa structure bidimensionnelle avec des carbones sp2. L'interaction physique des nanoparticules de graphène avec les membranes cellulaires est l'une des principales causes de la cytotoxicité du graphène. Le graphène a une grande capacité à se lier aux structures -hélicoïdales des peptides en raison de sa courbure de surface favorable. À une concentration supérieure à 75 g/mL, le graphène vierge adhère largement à la surface des cellules RAW 264.7 et entraîne un étirement anormal de la membrane cellulaire. Les fortes interactions hydrophobes des GFN avec la membrane cellulaire conduisent à l'extension morphologique du dysfonctionnement filopodial et cytosquelettique de l'actine F. De plus, les bords aiguisés du GNS peuvent agir comme des « lames », insérant et coupant à travers les membranes cellulaires bactériennes. De plus, GO a également endommagé directement la membrane externe des bactéries E. coli, entraînant la libération de composants intracellulaires. Cependant, l'imagerie TEM a révélé que le pré-revêtement de GO avec FBS éliminait la destruction des membranes cellulaires.
Production de ROS conduisant au stress oxydatif
Le stress oxydatif survient lorsque l'augmentation des niveaux de ROS dépasse l'activité des enzymes antioxydantes, notamment la catalase, la SOD ou la glutathion peroxydase (GSH-PX). Les ROS agissent comme seconds messagers dans de nombreuses cascades de signalisation intracellulaire et entraînent des dommages macromoléculaires cellulaires, tels que la dégradation des lipides membranaires, la fragmentation de l'ADN, la dénaturation des protéines et le dysfonctionnement mitochondrial, qui influencent grandement le métabolisme cellulaire et la signalisation. Les interactions de GO avec les cellules peuvent conduire à une génération excessive de ROS, qui est la première étape des mécanismes de cancérogenèse, de vieillissement et de mutagenèse. Le stress oxydatif a joué un rôle important dans les lésions pulmonaires aiguës induites par GO, et les réponses inflammatoires causées par le stress oxydatif sont souvent apparues lors de l'exposition aux GFN. L'activité de la SOD et du GSH-PX a diminué après exposition au GO d'une manière dépendante du temps et de la dose. De même, le stress oxydatif était la principale cause de l'apoptose et des dommages à l'ADN après l'exposition des cellules HLF à GO.
La protéine kinase activée par les mitogènes (MAPK) (JNK, ERK et p38) et les voies de signalisation liées au TGF-bêta ont été déclenchées par la génération de ROS dans des cellules traitées au graphène vierge, accompagnées de l'activation de Bim et Bax, qui sont deux pro -membres apoptotiques de la famille des protéines Bcl-2. En conséquence, la caspase-3 et ses protéines effectrices en aval telles que PARP ont été activées et l'apoptose a été initiée. Des informations détaillées concernant les voies de signalisation liées à MAPK, TGF-β et TNF-α, qui induisent l'inflammation, l'apoptose et la nécrose, sont résumées dans la figure 4.
Diagramme schématique des voies dépendantes des MAPK, TGF-beta et TNF-α impliquées dans la toxicité des GFN. Les ROS étaient les principaux facteurs activant les voies de signalisation MAPK et TGF-beta pour conduire à l'activation de Bim et Bax, déclenchant la cascade de caspases et la voie JNK. L'activation de la caspase 3 et de RIP1 a finalement entraîné l'apoptose et la nécrose
Dommages mitochondriaux
Les mitochondries sont des centres de production d'énergie impliqués dans diverses voies de signalisation dans les cellules et sont également un point clé de la régulation apoptotique. Après exposition au GO et au carboxyle graphène (GXYG), la membrane mitochondriale s'est dépolarisée et la quantité de mitochondries a diminué dans les cellules HepG2. L'exposition aux GFN a entraîné une augmentation significative de la consommation d'oxygène mitochondrial couplé et non couplé, la dissipation du potentiel de la membrane mitochondriale et le déclenchement éventuel de l'apoptose en activant la voie mitochondriale. Par exemple, GO a augmenté l'activité des complexes de transport d'électrons mitochondriaux I/III et la fourniture d'électrons au site I/II de la chaîne de transport d'électrons, accélérant la génération de ROS pendant la respiration mitochondriale dans les cellules MHS. La formation de •OH médiée par GO et le système de transfert d'électrons cytochrome-c/H2O2 pourrait augmenter le stress oxydatif et thermique pour altérer le système de respiration mitochondriale et éventuellement entraîner une toxicité dramatique. De plus, les fragments d'oxygène sur GO pourraient accepter les électrons des protéines redox cellulaires, soutenant le cycle redox du cytochrome c et des protéines de transport d'électrons, et les cytochromes MtrA, MtrB et MtrC/OmcA pourraient être impliqués dans le transfert d'électrons vers GO. Par conséquent, à l'exception des dommages à la membrane plasmique et de l'induction du stress oxydatif, les GFN peuvent provoquer une apoptose et/ou une nécrose cellulaire en influençant directement l'activité mitochondriale cellulaire.
Dommages à l'ADN
En raison de sa petite taille, de sa surface spécifique et de sa charge de surface élevées, GO peut posséder des propriétés génotoxiques importantes et causer de graves dommages à l'ADN, par exemple une fragmentation chromosomique, des ruptures de brins d'ADN, des mutations ponctuelles et des adduits et altérations oxydatifs de l'ADN. Une mutagenèse a été observée chez la souris après injection intraveineuse de GO à la dose de 20 mg/kg par rapport au cyclophosphamide (50 mg/kg), mutagène classique. Même si GO ne peut pas entrer dans le noyau d'une cellule, il peut toujours interagir avec l'ADN pendant la mitose lorsque la membrane nucléaire se rompt, ce qui augmente le risque d'aberrations de l'ADN.
L'interaction d'empilement π entre les anneaux de carbone du graphène et les paires de bases d'ADN hydrophobes peut faire qu'un segment d'ADN « se dresse » ou « pose » sur la surface du graphène avec son axe hélicoïdal perpendiculaire ou parallèle, respectivement. Les forces intermoléculaires déforment sévèrement les paires de bases terminales de l'ADN, ce qui augmente potentiellement la génotoxicité. GO peut également induire une fragmentation chromosomique, des adduits d'ADN et des mutations ponctuelles en favorisant le stress oxydatif ou en déclenchant une inflammation via l'activation de voies de signalisation intracellulaires telles que MAPK, TGF-β et NF-κB. Le graphène et le rGO peuvent également augmenter l'expression de p53, Rad51 et MOGG1-1, qui reflètent les dommages chromosomiques, et diminuer l'expression de CDK2 et CDK4 en arrêtant la transition du cycle cellulaire de la phase G1 à la phase S dans diverses lignées cellulaires. Les dommages à l'ADN peuvent non seulement initier le développement du cancer, mais également menacer la santé de la prochaine génération si le potentiel mutagène de GO apparaît dans les cellules reproductrices, ce qui a un impact sur la fertilité et la santé de la progéniture.
Réaction inflammatoire
Les GFN peuvent provoquer une réponse inflammatoire significative, notamment une infiltration cellulaire inflammatoire, un œdème pulmonaire et la formation de granulomes à fortes doses via une instillation intratrachéale ou une administration intraveineuse.
Les plaquettes sont des composants importants dans la formation de caillots pour attaquer les agents pathogènes et les particules pendant la réponse inflammatoire, et GO pourrait activer directement la formation de thrombus riches en plaquettes pour obstruer les vaisseaux pulmonaires après injection intraveineuse. Une forte réponse inflammatoire a été induite par une injection sous-cutanée de GO pendant 21 jours, ainsi que la sécrétion de cytokines clés, notamment IL-6, IL-12, TNF-α, MCP-1 et IFN-g. Les GFN peuvent déclencher une réponse inflammatoire et des lésions tissulaires en libérant des cytokines et des chimiokines qui conduisent au recrutement de monocytes circulants et en stimulant la sécrétion de cytokines et de chimiokines Th1/Th2. De plus, le graphène vierge et le rGO provoquent une réponse inflammatoire en se liant aux récepteurs Toll-like (TLR) et en activant la voie de signalisation NF-κB dans les cellules. La cascade de signalisation NF-κB est déclenchée par les TLR et les cytokines pro-inflammatoires telles que l'IL-1 et le TNF-α. Lors de l'activation, NF-κB se déplace du cytoplasme vers le noyau, facilitant la liaison d'IκB dégradant et agissant comme un facteur de transcription pour synthétiser de nombreuses cytokines pro-inflammatoires. Un schéma de la voie de signalisation de TLR4 et TLR9 activé par les GFN est illustré à la Fig. 5.
Un diagramme schématique élucidant la voie de signalisation de TLR4 et TLR9 responsable de la cytotoxicité induite par les GFN. Les GFN peuvent être reconnus par les TLR, activent ainsi IKK et IκB par un mécanisme dépendant de MyD88, entraînant la libération de sous-unités NF-κB et initiant la translocation dans le noyau. Ainsi, des facteurs pro-inflammatoires ont été transcrits et sécrétés hors du noyau, modulant les réponses immunitaires initiant l'autophagie programmée, l'apoptose et la nécrose.
Apoptose
L'apoptose est définie comme l'autodestruction d'une cellule régulée par des gènes à travers des programmes compliqués. GO et rGO ont provoqué l'apoptose et l'inflammation dans les poumons de souris après inhalation, et les GFN ont également eu des effets pro-apoptotiques dans les cellules. De plus, le graphène et le GO endommagent physiquement les membranes cellulaires, augmentent la perméabilisation de la membrane mitochondriale externe et modifient le potentiel de la membrane mitochondriale ; l'augmentation des ROS a déclenché les voies de signalisation MAPK et TGF-β et activé la caspase-3 via des cascades apoptotiques dépendantes des mitochondries, provoquant l'exécution de l'apoptose.
De même, rGO a provoqué une apoptose à faible dose et à un moment précoce, déclenchée par le récepteur de la mort et la voie mitochondriale canonique. Une autre étude a montré trois voies d'apoptose différentes par les GFN : GO a conduit à l'apoptose dépendante des ROS par interaction directe avec les récepteurs protéiques et activation ultérieure de la voie du lymphome à cellules B-2 (Bcl-2); GO-COOH a transmis un signal d'apoptose passive à l'ADN nucléaire en se liant aux récepteurs protéiques et en activant une voie indépendante de ROS ; Cependant, GO-PEI a gravement endommagé les membranes des lymphocytes T pour déclencher l'apoptose.
Autophagie
L'autophagie est le processus d'auto-dégradation des composants cellulaires et récemment reconnu comme la mort cellulaire non apoptotique. L'activation de l'autophagie nécessite la formation d'autophagosome contenant Beclin 1, plusieurs protéines liées à l'autophagie (ATG), la chaîne légère 3 des protéines associées aux microtubules (LC3) et p62. L'accumulation d'autophagosome est associée à l'exposition à diverses nanoparticules, et l'autophagie peut éliminer les organismes extracellulaires et détruire les organismes du cytosol. Il a été démontré que GO et GQD induisaient une accumulation d'autophagosomes et la conversion de LC3-I en LC3-II ; inhiber la dégradation de la protéine p62 substrat autophagique. De plus, GO peut déclencher simultanément des réponses TLR4 et TLR9 dans les macrophages et les cellules cancéreuses du côlon CT26. La voie de l'autophagie est liée à la phagocytose par la signalisation TLR dans les macrophages.
Nécrose
La nécrose est une forme alternative de mort cellulaire induite par des réponses inflammatoires ou des lésions cellulaires. L'exposition des cellules au graphène vierge provoque l'apoptose et la nécrose à fortes doses (50 mg/mL). Il semblerait que la fuite de LDH et l'ouverture du pore de transition de perméabilité mitochondriale, induites par un niveau élevé de Ca2+ cytoplasmique, conduisent à l'apoptose/nécrose. Le traitement par GO s'est révélé induire une nécrose macrophagique en activant la signalisation TLR4 et en déclenchant par la suite en partie la production autocrine de TNF-α. GO combiné avec CDDP (GO/CDDP) a déclenché une nécrose en diminuant RIP1 et en augmentant les protéines RIP3, accompagné de la libération du groupe à haute mobilité B1 (HMGB1) dans le cytosol à partir du noyau et des cellules CT26.
Changements épigénétiques
L'épigénétique implique la méthylation de l'ADN, l'empreinte génomique, les effets maternels, l'extinction des gènes et l'édition de l'ARN. La méthylation de l'ADN, qui est l'une des modifications épigénétiques les mieux étudiées, comprend la phosphorylation, l'ubiquitination et l'ATP-ribosylation et peut conduire au remodelage de la chromatine.
Un article récent a rapporté que l'exposition à SL-GO/FL-GO entraînait une hyperméthylation globale de l'ADN par la régulation positive des gènes DNMT3B et MBD1 ; Le traitement au GNP a provoqué une hypométhylation en diminuant l'expression des gènes DNMT3B et MBD1. GO pourrait activer la voie de régulation miARN-360 pour supprimer la cascade de signalisation des dommages à l'ADN-apoptose en affectant le composant de CEP-1. Prises ensemble, ces données suggèrent que les GFN pourraient provoquer des changements subtils dans la programmation de l'expression génique en modulant les changements épigénétiques. Cependant, les études sur les changements épigénétiques induits par les GFN sont peu nombreuses et le mécanisme épigénétique causé par l'exposition aux GFN n'est pas entièrement compris.
Pour conclure, de nombreuses études ont discuté des mécanismes représentatifs de la toxicité des GFN impliquant quatre voies de signalisation : TLR, TGF-β, TNF-α et MAPK. Ces quatre voies de signalisation sont corrélatives et modulatrices croisées, rendant la réponse inflammatoire, l'autophagie, l'apoptose et d'autres mécanismes indépendants et pourtant connectés les uns aux autres. De plus, le stress oxydatif semble jouer le rôle le plus important dans l'activation de ces voies de signalisation. Il a été rapporté qu'il existe des intersections d'apoptose, d'autophagie et de nécrose dans les études de toxicité d'autres nanomatériaux, ils s'inhibent ou se favorisent mutuellement dans certaines conditions. Cependant, les voies de signalisation de la toxicité des GFN étudiées dans les articles à ce jour ne sont qu'une petite partie d'un réseau complexe, et le réseau de voies de signalisation doit être exploré en détail à l'avenir.
Lacunes dans les données et études futures
Actuellement, la littérature est insuffisante pour tirer des conclusions sur les dangers potentiels des GFN. Deux opinions opposées ont commencé à émerger : certains chercheurs ont suggéré que les matériaux de graphène sont biocompatibles dans un certain nombre d'études axées sur les applications biomédicales, et d'autres études ont signalé des réponses biologiques indésirables et une cytotoxicité. Ces résultats incohérents pourraient avoir été causés par plusieurs facteurs, notamment les différents groupes de recherche, divers modèles cellulaires ou animaux et diverses caractérisations physico-chimiques des GFN. Lorsque les GFN sont explorés pour des applications in vivo dans le corps humain ou certaines autres applications biomédicales, la biocompatibilité doit être prise en compte, et des études plus détaillées et plus précises de la toxicité des GFN sont nécessaires.
Premièrement, une caractérisation physico-chimique détaillée est impérative dans toutes les futures études sur la toxicité des GFN. Dans les expériences, les descriptions des caractéristiques des GFN doivent inclure leur taille, leur morphologie, leur surface, leur charge, leurs modifications de surface, leur pureté et leur agglomération.
Étant donné que ces facteurs physico-chimiques influencent largement la toxicité et la biocompatibilité des GFN, des conceptions expérimentales à facteur unique et l'exclusion d'autres facteurs interférents doivent être envisagées. Des détails sur le processus de fabrication doivent également être fournis car les débris oxydatifs formés pourraient altérer largement la structure de surface du graphène et du GO lors de la fonctionnalisation.
Il est important de noter qu'une méthode unique et universelle doit être établie dans la technologie du graphène, ce qui permettra une meilleure comparaison des données de différentes études ou de différents laboratoires.
Deuxièmement, différents critères d'observation, paramètres et sélection de méthodes expérimentales pourraient induire de grandes variations inter-laboratoires.
Par exemple, le test MTT ne parvient toujours pas à prédire avec précision la toxicité du graphène car la réduction spontanée entraîne un faux signal positif. Par conséquent, des évaluations alternatives appropriées doivent être utilisées, telles que le réactif au sel de tétrazolium soluble dans l'eau (WST-8), le test ROS et le test d'exclusion au bleu trypan.
De plus, le test des comètes montre souvent des niveaux plus élevés de dommages à l'ADN que le test du micronoyau, car le premier mesure la blessure réparable et le second mesure les dommages génétiques qui subsistent après la division cellulaire. Par conséquent, la prudence est de mise dans le choix du test le plus approprié pour évaluer la toxicité des matériaux à base de graphène afin d'éviter des résultats faussement positifs.
Troisièmement, la sélection des lignées cellulaires est d'une importance vitale car les lignées cellulaires cancéreuses ont tendance à être sensibles ou résistantes en fonction de leur patrimoine génétique. Les mêmes nanoparticules de graphène peuvent provoquer des réactions différentes selon leurs différentes origines cellulaires. Des lignées cellulaires appropriées avec une bonne stabilité doivent être utilisées pour éviter des résultats faussement positifs ou négatifs. Les cellules primaires dérivées d'humains ou d'animaux peuvent mieux simuler les conditions de santé des humains. Une grande quantité de cellules primaires a été utilisée pour tester la toxicité d'autres nanomatériaux, mais la culture de cellules primaires est extrêmement rare dans les expériences avec les GFN à ce jour. Diverses expériences cellulaires combinées avec des cellules primaires doivent être effectuées pour évaluer de manière exhaustive les propriétés physico-chimiques et la toxicité des GFN.
Quatrièmement, la voie d'administration des GFN joue un rôle très important dans les études de toxicité, et différentes méthodes d'administration entraîneront différentes réactions toxicologiques. Ainsi, la voie et la période d'exposition doivent être soigneusement choisies en fonction de l'objectif de l'étude. L'administration nasale de médicament est souvent utilisée pour étudier la neurotoxicité des nanomatériaux, mais cette méthode d'administration a rarement été appliquée dans les tests de toxicité des GFN.
Les études toxicologiques des GFN dans le système nerveux sont rares, et le mécanisme n'est pas clair et doit être étudié plus avant à l'avenir. Des études toxicocinétiques récentes portant sur l'absorption, la distribution, le métabolisme, l'accumulation et l'excrétion des GFN par différentes voies d'exposition ont donné quelques résultats mais sont loin d'être suffisantes pour clarifier les mécanismes complexes internes. Par exemple, des études supplémentaires sont nécessaires pour comprendre les mécanismes moléculaires spécifiques des GFN traversant les barrières physiologiques et la quantité d'accumulation ou la période d'excrétion des GFN dans les tissus. De plus, compte tenu de l'exposition accrue de l'homme aux GFN, l'évaluation de la toxicité systémique dans le corps humain est indispensable dans les futures études.
Cinquièmement, une autre question importante nécessitant une attention particulière est le sort à long terme des GFN après leur entrée dans le corps ou leur absorption par les cellules. Les études les plus récentes ont consisté en des évaluations de toxicité à court terme, et les lésions toxiques à long terme n'ont pas reçu beaucoup d'attention depuis l'application généralisée des GFN en 2008. De plus, une surface de graphène fonctionnalisée peut améliorer sa biocompatibilité, mais la la stabilité à long terme des revêtements de surface doit être prise en compte. Si les revêtements de surface finissent par se décomposer, leur toxicité peut être très différente des résultats d'exposition à court terme. Des études approfondies sont nécessaires pour déterminer si des durées de traitement plus longues influencent le potentiel nanotoxique des GFN.
Sixièmement, des voies de signalisation plus spécifiques dans le mécanisme de la toxicité des GFN doivent être découvertes et élucidées. Actuellement, plusieurs mécanismes de toxicité typiques des GFN ont été illustrés et largement acceptés, tels que le stress oxydatif, l'apoptose et l'autophagie. Cependant, ces mécanismes n'ont été décrits qu'en termes généraux, et les voies de signalisation spécifiques au sein de ces mécanismes doivent être étudiées en détail. Les voies de signalisation impliquées dans la toxicité d'autres nanomatériaux peuvent également être pertinentes pour l'étude des GFN. Par conséquent, davantage de voies de signalisation devraient être détectées dans les recherches futures.
Par exemple, la nano-épigénétique a été prise en compte dans de nombreuses études sur les nanomatériaux, ce qui est également utile pour évaluer la toxicité limitée et les effets secondaires des GFN. Des études récentes ont montré que les GFN pourraient provoquer des changements épigénétiques et génomiques qui pourraient stimuler la toxicité physique et la cancérogénicité. Les GFN ont des surfaces élevées, des surfaces continues lisses et une bio-persistance, similaires aux propriétés des implants à l'état solide tumorigènes. On ne sait pas si les GFN ont le potentiel d'induire des sarcomes à corps étrangers, et des études définitives sur les potentialités tumorales ou les risques du graphène devraient donc être menées dès que possible.
Conclusion
Au cours des dernières années, les GFN ont été largement utilisés dans un large éventail de domaines technologiques et biomédicaux. Actuellement, la plupart des expériences se sont concentrées sur la toxicité des GFN dans les poumons et le foie. Par conséquent, les études sur les lésions cérébrales ou la neurotoxicité méritent plus d'attention à l'avenir.
De nombreuses expériences ont montré que les GFN ont des effets secondaires toxiques dans de nombreuses applications biologiques, mais l'étude approfondie des mécanismes de toxicité est urgente. En outre, les résultats contrastés concernant la toxicité des GFN doivent être traités par des méthodes expérimentales efficaces et des études systématiques.
Cette revue donne un aperçu de la toxicité des GFN en résumant la toxicocinétique, les mécanismes de toxicité et les facteurs d'influence et visait à fournir des informations pour faciliter des recherches approfondies sur l'hémo- et la biocompatibilité in vitro et in vivo des GFN à l'avenir. Cet examen aidera à résoudre les problèmes de sécurité avant les applications cliniques et thérapeutiques des GFN, ce qui sera important pour le développement ultérieur des GFN dans les applications biologiques.
Abréviations
AM : Macrophages alvéolaires
BBB : Barrière hémato-encéphalique
BEB : Barrières sang-épididyme
BTB : Barrière hémato-testiculaire
RC : Récepteur du complément
FcgR : récepteur Fcg
FLG : Graphène à quelques couches
GFN : Nanomatériaux de la famille du graphène
GNS : Nanofeuillets de graphène
GO: Oxyde de graphène
GO-COOH : Oxyde de graphène carboxylé
GO-DEX : GO-dextrane
GO-MB : GO-balise moléculaire
GO-NH2 : GO aminé
GO-PAA : GO fonctionnalisé poly(acide acrylique)
GO-PAM : GO fonctionnalisé poly(acrylamide)
GO-PEG : Dérivés GO pégylés
GO-Î.-P.-É. : GO-polyéthylèneimine
GQD : Points quantiques de graphène
GSH-PX : Glutathion peroxydase
GXVG : carboxyle graphène
LDH : Lactate et déshydrogénase
MALDI : Désorption/ionisation laser assistée par matrice
MAPK : Protéine kinase activée par un mitogène
MDA : Malondialdéhyde
MØ : Macrophage
MR: Récepteur du mannose
MSI : Imagerie par spectrométrie de masse
Cellules PC12 : Cellules de phéochromocytome de rat
PCGO : Nanoparticules d'oxyde de graphène enrobées de protéines
PrGO : Oxyde de graphène réduit pégylé
RES : Système réticulo-endothélial
rGO : Oxyde de graphène réduit
ROS : Les espèces réactives de l'oxygène
SOD: Superoxyde dismutase
TLR : Récepteur de type péage
Source du Document : https://particleandfibretoxicology.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12989-016-0168-y